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細(xì)胞培養(yǎng)常見問題解決!
點(diǎn)擊次數(shù):2363 更新時(shí)間:2018-08-10

實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)之總結(jié)(四十五):細(xì)胞培養(yǎng)常見問題解決!

1、如何儲(chǔ)存和解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損? 

建議血清應(yīng)保存在-2O℃。若一次無法用完一瓶,無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi),再放回冷凍。將血清從冷凍箱取出后,置于2~8℃冰箱使之緩慢融解,一般是融解過夜。

 2、血清中包含絮狀沉淀,它們是什么,怎么處理? 

沉淀主要成分是纖維蛋白和脂蛋白,不會(huì)影響血清品質(zhì)。 首先讓其沉淀在瓶子底部,中上層無沉淀血清直接轉(zhuǎn)出使用,下層血清裝到50ml無菌離心管,400g,離心3分鐘即可除去 (一般不建議采用過濾的方法除去沉 淀,因?yàn)槌恋頃?huì)堵塞濾膜而無法過濾)。

3、實(shí)驗(yàn)室如何選擇適合的血清? 

稀有的澳洲血清培養(yǎng)嬌貴細(xì)胞(小鼠ES、原代細(xì)胞分離培養(yǎng)),南美血清或國(guó)產(chǎn)胎牛血清用于癌細(xì)胞、常規(guī)細(xì)胞系培養(yǎng)(用量大),新生牛血清用于病毒包裝(構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株)。

4、微生物培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后,可長(zhǎng)期保存嗎? 

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí),您應(yīng)該在兩周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。

 5、有必要做熱滅活嗎?

實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)過正確處理的熱滅活血清,對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn),或*沒有任何作用,甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量,而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清,沉淀物的形成會(huì)顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點(diǎn)”,常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37℃環(huán)境中,又會(huì)使此沉淀物更增多,使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。 若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間,更確保血清的質(zhì)量!

6、細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑點(diǎn)是污染嗎?如何處理? 

一旦您在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)有黑點(diǎn)生成,首先,要肉眼觀察微生物培養(yǎng)基是否混濁,然后,在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài),黑點(diǎn)是否游動(dòng)。如果細(xì)胞被污染,微生物則會(huì)大量繁殖,微生物培養(yǎng)基就會(huì)迅速變黃、變混濁。污染包括細(xì)菌污染、支原體污染等。 如果在鏡下觀察細(xì)胞,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,與黑點(diǎn)出現(xiàn)前相比,沒有任何變化,那么,黑點(diǎn)的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關(guān)

(1)細(xì)胞生長(zhǎng)過老,破碎的細(xì)胞殘骸;

(2)血清質(zhì)量不好,反復(fù)凍融的結(jié)果;

(3)配制培養(yǎng)基的pH值偏高,不宜細(xì)胞生長(zhǎng);

(4)培養(yǎng)原代細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn),可能是原代組織中的雜質(zhì),多次傳代可以消除。

 7、EDTA在細(xì)胞消化過程中起什么作用?

EDTA是一種螯合劑,它可以螯合Ca2+ 或Mg2+,而細(xì)胞表面很多和培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶結(jié)合的蛋白都是帶有Ca2+ 或Mg2+的,把這些離子螯合后,可以加速細(xì)胞和培養(yǎng)皿的脫離,促進(jìn)消化。上皮類細(xì)胞的連接存在“橋粒”結(jié)構(gòu),是細(xì)胞間“牢固”的連接,但橋粒的形成依賴于鈣離子的存在。在胰酶消化細(xì)胞時(shí),加入EDTA,可以破壞細(xì)胞的橋粒結(jié)構(gòu),使細(xì)胞能夠分散成單個(gè)細(xì)胞。通俗地說,就是破壞細(xì)胞間的粘連。

8、如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基?

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。選DMEM做貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。另外還可以參考ATCC的推薦信息。

9、 怎樣讓細(xì)胞適應(yīng)新的條件?

從原條件逐漸過度:1/4、1/2、3/4,后是*新培養(yǎng)基。

10、為何微生物培養(yǎng)基保存于4℃,顏色會(huì)偏暗紅色?

(1).培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會(huì)逐漸溢出,造成微生物培養(yǎng)基越來越偏堿性。顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。

(2).培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果,將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。需調(diào)整pH值至7.0~7.2. 11、細(xì)胞凍存管應(yīng)如何解凍? 37℃,1~2分鐘內(nèi)全部融解。 冷凍管建議放在液氮液面上面,由液氮桶中取出解凍時(shí),必須注意安全(戴護(hù)目鏡),預(yù)防冷凍管之爆裂。

11、細(xì)胞凍存管應(yīng)如何解凍? 可能原因:

(1)胰蛋白酶消化過度

(2)支原體污染

(3)消化液或培養(yǎng)液配制錯(cuò)誤、過期儲(chǔ)存、儲(chǔ)存不當(dāng)

(4)細(xì)胞老化(如傳代前細(xì)胞已匯合導(dǎo)致失去貼附性)

(5)接種細(xì)胞起始濃度太低或太高 解決辦法: 1. 準(zhǔn)備一個(gè)培養(yǎng)容器,內(nèi)裝合適體積的適宜培養(yǎng)基,并使其溫度和pH與建議的相稱 。 2. 在37℃或該細(xì)胞系正常生長(zhǎng)溫度水浴下通過輕柔搖動(dòng)迅速溶解凍存管(約2分鐘); 3. 管中內(nèi)容物溶解后立刻將凍存管移到超凈工作臺(tái)內(nèi),并用70%酒精消毒表面防止污染,注意無菌操作。 4. 擰開凍存管蓋,將管中內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到已裝有少量培養(yǎng)液的無菌離心管中稀釋,離心(一般125g,10分鐘),棄去上清并用1~2ml*培養(yǎng)基重新懸浮沉淀細(xì)胞,然后轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮液到培養(yǎng)容器內(nèi)混合均勻。注意:如果凍存液中含5% DMSO,則不必離心,只需用15ml培養(yǎng)液懸浮即可。因?yàn)镈MSO在這個(gè)濃度時(shí)沒有毒性。 5.24小時(shí)后檢查培養(yǎng)情況,如果需要的話進(jìn)行擴(kuò)傳。有些細(xì)胞系(比如雜交瘤細(xì)胞)從凍存狀態(tài)恢復(fù)需要幾天時(shí)間。 實(shí)際上,一些雜交瘤細(xì)胞在天培養(yǎng)液中出現(xiàn)死亡細(xì)胞并產(chǎn)生許多細(xì)胞殘骸。許多細(xì)胞凍存后活力下降并在融化后24小時(shí)到一個(gè)低狀態(tài)。此后細(xì)胞將恢復(fù)并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞復(fù)蘇過程不是很難,主要是速溶這步很關(guān)鍵。再有,細(xì)胞復(fù)蘇的狀態(tài)如何,較大程度上取決于細(xì)胞凍存時(shí)的操作。還有一點(diǎn),細(xì)胞也是有思想的,你對(duì)他好,關(guān)心他照顧他,他也不會(huì)讓你失望的。

DC2.4小鼠樹突狀細(xì)胞    B-CPAP細(xì)胞培養(yǎng)說明書

 

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