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2×GoldStar Best MasterMix（無染料）說明書
貨號：K0656
保存條件：-20℃長期保存，如需頻繁使用，可存放于2-8℃，盡量避免反復(fù)凍融。
組分說明
Cat. No. K0656 K0656B
Kit Size 1 ml 5×1 ml
2×GoldStar Best MasterMix 1 ml 5×1 ml
RNase-Free Water 1 ml 5 ml
注意：2×GoldStar Best MasterMix含有GoldStar Best DNAPolymerase,
2×GoldStar Best PCR Buffer, 3 mM MgCl2和400 µM dNTPs。
產(chǎn)品簡介
本品為由GoldStar Best DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成的預(yù)混體系，濃度為 2×，具有操作簡便快速、靈敏度高、特異性2+強(qiáng)、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，可最大限度地減少人為誤差和污染。該產(chǎn)品所含的 GoldStarBest DNA Polymerase是經(jīng)過特殊處理的熱啟動高保真聚合酶。該聚合酶具有5′-3′DNA聚合酶活性，5′-3′核酸外切酶活性和 3′-5′核酸外切酶活性，在普通PCR條件下，與GoldStar Taq DNA Polymerase相比，具有擴(kuò)增效率高、錯配率低的優(yōu)良性能。化學(xué)修飾使該酶在常溫下沒有聚合酶活性，有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結(jié)合或引物二聚體而產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增，酶的激活須在 95℃下孵育10分鐘，該條件可以整合入已有的PCR熱循環(huán)程序。優(yōu)化的緩沖體系使酶的作用發(fā)揮最大功效，實(shí)現(xiàn)對目的片段的高保真、高特異性、高擴(kuò)增效率、高靈敏度擴(kuò)增。本品不含染料，PCR程序結(jié)束后可根據(jù)需要加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳操作。擴(kuò)增得到的 PCR產(chǎn)物3′端附有一個“A"堿基，因此可直接用于 T/A克隆。適用于常規(guī)的 PCR反應(yīng)和對高保真性有要求的基因克隆等實(shí)驗(yàn)。
質(zhì)量控制
經(jīng)檢驗(yàn)無外源核酸酶活性； PCR方法檢測無宿主殘余DNA；能有效地?cái)U(kuò)增多種基
因組中的單拷貝基因；2-8℃存放三個月，活性無明顯改變。
本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途
使用方法
以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的
片段大小不同進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。
1. PCR反應(yīng)體系
試劑 50 μl反應(yīng)體系 終濃度
2×GoldStar Best MasterMix 25 μl 1×
Forward Primer，10 µM 2 μl 0.4 μM
Reverse Primer，10 µM 2 μl 0.4 μM
Template DNA <1 μg <1 μg/reaction
RNase-Free Water up to 50 μl
注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
2. PCR反應(yīng)條件
步驟 溫度 時(shí)間
預(yù)變性 95℃ 10 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 30-40個循環(huán)
延伸 72℃ 60 s
終延伸 72℃ 5 min
注意：1）一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
2）延伸時(shí)間應(yīng)根據(jù)所擴(kuò)增片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品中所包含的GoldStar Best DNA Polymerase的擴(kuò)增效率為1 kb/min。
3）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯配機(jī)率會增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
4）本產(chǎn)品須在預(yù)變性95℃，10 min條件下實(shí)現(xiàn)酶的活化。
3.結(jié)果檢測：本產(chǎn)品不含染料，反應(yīng)結(jié)束后，取5 µl反應(yīng)產(chǎn)物加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
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